mIHC多重荧光免疫组化之实验指南

mIHC利用酪酰胺信号放大(TSA)技术，荧光素标记酪酰胺（Tyramide）在二抗携带的HRP酶促作用下，生成活化荧光底物与靶标蛋白的酪氨酸共价结合，从而使靶标蛋白标记上特定的荧光。随后通过剥离洗去非共价结合的抗体，再重复操作换下一个指标的一抗搭配另一种Tyramide进行染色，如此往复可在同一张切片上实现双标三色（货号RS0036）到六标七色（货号RS0039）甚至更多指标同时分析。

将玻片沥干几秒钟，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，滴加适量试剂B（货号RS0053）覆盖组织切面（通常50~100uL），室温孵育15 min，PBST 冲洗 2 min × 3 次。

将玻片沥干几秒钟，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，用免疫组化笔将组织圈起来。

将稀释好的一抗工作液滴加到组织上，直至完全覆盖组织，室温或 37℃ 孵育 1~2 小时，或 4℃湿盒中过夜后37℃复温 30 min，PBST 冲洗2 min ×3 次。

将玻片沥干，用滤纸把组织周围的水分擦掉后，滴加试剂 C（货号RS0011）覆盖组织，室温孵育 30 min，PBST 冲洗 2 min × 3 次。

加入荧光染料试剂 D-594 工作液覆盖组织，10min后，PBST 冲洗 2 min × 3 次。

加入适量 37℃预热好的试剂 F(货号YS0124)覆盖组织，37℃放置 5-20min，甩干后无需洗涤再次滴加适量抗体剥离液覆盖组织37℃放置 5-20min，弃剥离液，PBST 洗三次，每次 5min。

重复步骤 3-6（孵育第二支一抗，中间荧光染料改为试剂 D-488）。如需做多指标染色，循环重复步骤3-6，并更换对应靶点的一抗和荧光染料。

滴一滴试剂 G（约 30-50ul）在组织切片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

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